Usuari:Xavier Dengra/proves1
La disrupció cel·lular és el procés de trencament de les cobertes d'una cèl·lula de manera intencionada per a finalitats biotecnològiques, i en què aquesta ruptura de les membranes o parets cel·lulars forma part d'un procediment més ampli que té com a finalitat recuperar algun producte d'interès de caràcter intracel·lular. Aquests productes intracel·lulars es produeixen en la majoria de casos de forma soluble al citoplasma o en cossos d'inclusió, lloc en el qual s'acumulen en grans quantitats.[1]
Es tracta, doncs, d'un procés de lisi delicat, en què les majors dificultats sorgeixen pel fet de tractar-se d'una ruptura cel·lular no controlada i resultant d'un alliberament sense impediments de tots els productes intracel·lulars (proteïnes, àcids nucleics, restes cel·lulars...).[2] Un cop dut a terme, el producte obtingut haurà de passar per diversos processos de separació i purificació depenenent de les necessitats de comercialització.
Consideracions prèvies
[modifica]El pas previ a la disrupció cel·lular és l'anàlisi exhaustiu de les característiques del producte d'interès que es vol aïllar i purificar. Per una banda, cal prendre èmfasi en els factors que propicien la pèrdua de propietats o la degradació, així com considerar els aspectes de la línia cel·lular de l'espècie amb la ques vol aplicar el procés, i més en concret la seva coberta cel·lular. Aquest conjunt de situacions són els que determinaran el mètode exacte de disrupció.
Factors interns i externs del procés
[modifica]Hi ha certs requisits per a la interrupció de la cèl·lula sense la desnaturalització del producte desitjat.[2] A l'hora de caracteritzar la disrupció, les propietats principals a tenir en compte quant a aquest fet són el pH, la generació de calor i augment de la temperatura, els agents químics que es puguin emprar, l'estrès mecànic de la cèl·lula, la generació d'escuma i la toxicitat per metalls.[3]
Quant a factors intínsecs i interns de la cèl·lula, cal vigilar l'alliberament de proteases i la contaminació per àcids nucleics.
Línies cel·lulars d'interès
[modifica]Els tipus cel·lulars més emprats a la bioindústria, i per tant, als que més cal produir disrupcions són els següents:[4]
- Cultius de cèl·lules de mamífer
- Cultius de cèl·lules vegetals
- Floridures
- Cèl·lules de llevat
- Teixits de col·lènquima
- Cèl·lules de bacteris grampositius
- Cèl·lules de bacteris gramnegatius
Membranes plasmàtiques
[modifica]
Formades a partir de lípids i proteïnes, el seu tret principal és que presenten un model de mosaic fluid organitzat en una bicapa fosfolipídica, els components de la qual flueixen pel pla de membrana.[5] Contenen, a més a més, una gran diversitat de receptors de membrana i enzims catalítics necessaris pel metabolisme intern cel·lular.
La presència d'una membrana plasmàtica afavoreix un aïllament selectiu dels medis extern i intern i proveeix d'una estructura de protecció envers agents patògens.[5] Per altra banda, les proteïnes incrustades en la mateixa duen a terme funcions de comunicació intercel·lular i transport selectiu de molècules.[6]
Parets cel·lulars
[modifica]
La paret cel·lular una matriu extracel·lular, una capa rígida que es localitza a l'exterior de la membrana plasmàtica i actua com a compartiment cel·lular intervenint en totes les relacions de la cèl·lula amb l'entorn. A més a més la paret cel·lular protegeix els continguts de la cèl·lula, dóna rigidesa a l'estructura cel·lular, i en el cas dels fongs i plantes, defineix l'estructura i confereix suport als teixits. També suporta la pressió de turgència.
Segons si l'organisme en té o no, se'n distingeixen diversos tipus, que comparteixen les característiques funcionals anteriors però difereixen quant a la seva composició.
Pel que fa a la paret cel·lular vegetal, consta de plasmodesmes (canalitzacions de comunicació intercel·lular), i de tres capes amb components diferents. En primer lloc, la paret primària fibril·lar, que és una paret constituïda per microfibril·les de cel·lulosa i hemicel·lulosa, que s’organitzen en graus de complexitat. La segueix la làmina mitjana, formada per pectina, i finalment la paret secundària matricial de caràcter opcional i que depèn de l'organisme. Aquesta última és més variable quant a contingut i comprèn hemicel·lulosa, pectines, proteïnes estructurals, substàncies d’incrustació (lignina, suberina i calosa) i aposicions (ceres i cutina).[7]
La paret cel·lular fúngica, per altra banda, està composta per dues capes de polisacàrids: la interna, transparent i amorfa, està constituïda principalment per β-glucans, mentre que a la capa externa s’hi troben ubicades les manoproteïnes, ancorades a la capa interna de β-glucans o bé travessant-la. Aquesta part externa té un gruix que suposa el 15-20% del pes sec de la cèl·lula.[8]
Relatiu a la paret cel·lular bacteriana, s'ha de distingir segons la classificació que els regeix per mètodes de tinció de Gram:
- Bacteris grampositius: és una estructura gruixuda i molt desenvolupada de peptidoglicà o mureïna, que compta amb incrustacions d'àcid teicoïc i lipoteicoïc.[1][9] Té un gran contingut d'aminoàcids, en concret alanina, àcid glutàmic i altres substàncies com lisina i DAP. Tenen, tanmateix, una sola bicapa lipídica i un baix contingut proteic i alt en lípids.
- Bacteris gramnegatius: en aquest cas, consta d'una xarxa de peptidoglicà molt fina organitzada en una sola capa. Compta també amb una membrana externa caracteritzada per la presència de porines i de lipopolisacàrids tòxics per altres espècies.[9]
Classificació general dels mètodes disruptius
[modifica]La classificació dels mètodes de disrupció s'estableix en dos grups principals: la mecànica, on actuen forces físiques no inherents a la mostra mitjançant equipament específic, i la no mecànica. Aquesta última agrupa la variant química - en què s'empren detergents i substàncies solubilitzadores de la coberta cel·lular - i la biològica o enzimàtica, on s'utilitzen enzims de microorganismes per a lisar la cèl·lula en qüestió i obtenir-ne els productes intracel·lulars.
| Disrupció física o mecànica | ||||||||||||||||
| MÈTODES DE DISRUPCIÓ CEL·LULAR | ||||||||||||||||
| Disrupció química | ||||||||||||||||
| Disrupció no mecànica | ||||||||||||||||
| Disrupció biològica o enzimàtica | ||||||||||||||||
Disrupció mecànica
[modifica]La variant mecànica o física és un tipus de disrupció de les membranes i parets de cèl·lules per mètodes severs, on s'hi troba involucrada una força física no inherent a la mostra que s'aplica mitjançant equipament específic. S'efectua sotmetent les cèl·lules a processos de cisallament per flux de líquid, explosió per diferències de pressió entre l'interior i l'exterior de la cèl·lula, forces de col·lisió per impacte de grans o paletes, trituració o tall de les preparacions, etc.[10] Ha estat històricament el mètode tradicional de lisi previ a tècniques més recents com l'aplicació de detergents i enzims.[11]
Les tècniques mecàniques es poden utilitzar en general en mostres humides, seques i congelades. No obstant, la seva eficiència és major en les mostres sòlides. Una característica significativa d'aquestes és que la fricció que provoquen genera calor, per la qual cosa sovint les mostres es congelen amb nitrogen líquid abans de tractar-les a fi de refredar tant el material cel·lular com la maquinària. Aquests processos criogenitzats fan que la mostra no només es fracturi més fàcilment, sinó que també conservi els anàlits làbils a altes temperatures o que poden degradar-se ràpidament després del trencament de la coberta, com ara l'ARN.[12]
No obstant, aquest grup de mètodes pateixen diversos inconvenients:[2]
- El fet que les cèl·lules es trenquin per complet i tots els materials intracel·lulars s'alliberin provoca que el producte d'interès hagi de ser separat d'una barreja complexa de proteïnes, àcids nucleics i fragments de paret cel·lular. Aquest àcids nucleics alliberats poden augmentar la viscositat de la solució i complicar les etapes downstream de separació i purificació, especialment les cromatografies.
- Les restes cel·lulars sovint consisteixen en fragments de cèl·lules petites, el que fa difícil clarificar la solució. L'alliberament complet del producte sovint requereix més d'un pas de disrupció, la qual cosa agreuja alhora el problema d'haver de reduir més encara la mida dels fragments. Aquests són difícils d'eliminar per centrifugació contínua — el rendiment de la centrifufgació és inversament proporcional al quadrat del diàmetre de la partícula — i per filtració — la naturalesa del homogeneïtzat sol ser gelatinosa —.
- L'extracció dels components d'interès es dóna en condicions molt dures. Si bé en l'actualitat s'accepta generalment que la majoria de les proteïnes poden tolerar l'alta pressió a l'interior d'un homogeneïtzador, la majoria seran desnaturalitzades per la calor generada (llevat que el dispositiu es refredi prou o que s'hagi realitzat el procés en condicions de congelació).
A fi d'agrupar tots aquests tractaments, des d'un punt de vista biològic la disrupció mecànica s'estructura en quatre blocs de treball:[13]
Molta
[modifica]La molta es basa en la creació de fricció gràcies a l'intercalat de la mostra entre dues superfícies dures que llisquen una contra l'altre. Aquesta força es separa en dos components: la pressió cap avall, acompanyada d'una força de tall tangencial. Com a conseqüència es produeix l'esquinçament de les mostres, tal com passa en el cisallament per homogeïnització, però en aquest cas no hi ha contacte directe entre mostra i homogeneïtzador. És especialment útil per a trencar desmosomes i unions estretes, i per a obtenir orgànuls sencers, ja que aquests no es veuen afectats per aquest tipus disruptiu.[14]
El morter és l'eina més coneguda per a la molta, acompanyada de variants del molí de gra, molinets de cafè i la premsa francesa (aquesta molt efectiva quant a la lisi bacteriana i d'estructures víriques). Amb aquestes eines, els sòlids es poden reduir a partícules molt fines, tot i que el resultat dependrà en part de la topologia de les superfícies de molta. És en aquest procediment en què la criogenització prèvia comporta una major eficiència.[13]
Homogeneïtzació cel·lular de suspensions
[modifica]Aquest procediment consisteix en el bombeig d'una suspensió o dissolució a través d'una vàlvula d'orifici restringit. Es produeix una elevada pressió (fins a 1.500 bars), que ve seguida per una expansió instantània a través d'un filtre de sortida d'especial. La disrupció es realitza per tres mecanismes diferents: l'impacte de la vàlvula, la capacitat cisalladora del líquid dins l'orifici, i la caiguda de pressió sobtada després de la descàrrega, que en conjunt finalitzen en una explosió de la cèl·lula. El mètode s'aplica principalment per a l'alliberament de molècules intracel·lulars, i els aparells més emprats són els homogeneïtzadors de vidre i en pipeta.[2]
Els homogeneïtzadors de vidre consisteixen en l'addició d'un tampó d'extracció i el teixit al tub homogeneïtzador, i a continuació, en la pressió continuada de la vàlvula sobre la mostra amb un moviment de torsió. El pistó puja i baixa mentre gira per ajudar a convertir la mostra, que passa a través de la petita superfície que hi ha entre el pistó i les parets de vidre de l'aparell. Tenen l'avantatge de ser molt fàcils de netejar i esterilitzar, però el seu cost és relativament elevat i són fàcils de trencar, a part que poden deixar restes fibroses i membranoses difícils de disgregar.[13]
Segons Hetherington et al. (1971)[15], una homogeneïtzació ve donada per una cinètica de primer ordre que pot expressar-se com a:
on sdsdkbsfkbi
El fet que el principi d'acció sigui l'alta pressió és un tret molt relacionat amb la molta, i sovint es tendeix a agrupar processos d'aquest tipus sota la mateixa denominació ja que els resultats que presenten són molt semblants.[13]
Molins de perles
[modifica]Referències
[modifica]- ↑ 1,0 1,1 Abdel-Latif, Monzir. «Cell disruption» (PDF). Islamic University of Gaza. [Consulta: 26 febrer 2015].
- ↑ 2,0 2,1 2,2 2,3 T. Tzannis, Steliod. «Tutorial on Cell Disruption». Rensselaer Polytechnic Institute, 03-06-1996. [Consulta: 26 febrer 2015].
- ↑ St. Mane. «Cell Disruption (Microorganisms)». Desmech.com, 14-12-2005. [Consulta: 26 febrer 2015].
- ↑ Ghosh, Raja. «Cell Disruption». A: Principles of Bioseparations Engineering (en anglès). Singapur: World Scientific Publishing, 2006, p. 49-64. ISBN 9812568921.
- ↑ 5,0 5,1 «Cell Membranes» (en anglès). Nature. [Consulta: 6 març 2015].
- ↑ M Cooper, Geoffrey. «Structure of the Plasma Membrane». A: The Cell: A Molecular Approach (en anglès). segona edició. Sunderland: Sinauer Associates, abril 2004. ISBN 0878931023.
- ↑ «Plant Cell Wall Basics» (en anglès). Universitat de Geòrgia. [Consulta: 9 març 2015].
- ↑ Bowman, SM; Free, SJ «The structure and synthesis of the fungal cell wall» (PDF de pagament) (en anglès). Bioassays. Wiley, 28, 8, agost 2006, pàg. 799-808. DOI: 10.1002/bies.20441.
- ↑ 9,0 9,1 «Structure and Function of Bacterial Cells» (en anglès). Online Textbook of Bacteriology. [Consulta: 9 març 2015].
- ↑ Goldberg, Stanley «2D PAGE: Sample Preparation and Fractionation Methods». Molecular Biology. Springer, 424, 2008, pàg. 3-22.
- ↑ «[https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1601757-Cell-Lysis-Handbook.pdf Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook]» (PDF) (en anglès). Thermo Scientific, 2009. [Consulta: 11 març 2015].
- ↑ Hussain But, R.; R. Coorssen, Jens «Pre-extraction Sample Handling by Automated Frozen Disruption Significantly Improves Subsequent Proteomic Analyses» (Document de pagament). Journal of Proteome Research, 5, 2, 2006, pàg. 437-448. DOI: 10.1021/pr0503634.
- ↑ 13,0 13,1 13,2 13,3 W. Burden, David «Guide to the Disruption of Biological Samples – 2012» (PDF) (en anglès). Random primers, 12, 1-2012, pàg. 1-25 [Consulta: 21 març 2015].
- ↑ H. Heidcamp, William. «Chapter 3: Cell Fractionation - Introduction» (en anglès). Gustavus Adolphus College. [Consulta: 20 abril 2015].
- ↑ Hetherington, P. J.; Follows, M.; Dunnill, P.; Lilly, M. D. (en anglès) Trans. Institut Americà d'Enginyers Químics, 1971, pàg. 142.